石蠟切片熒光tunel+IF實驗檢測凋亡熒光共定位-上海鄭核
一、實驗器材及試劑
1、實驗器材
名稱 廠家 型號
脫水機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5
病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司 RM2016
凍臺 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5
組織攤片機(jī) 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P
烤箱 上?；厶﹥x器制造有限公司 DHG-9140A
載玻片 Servicebio
蓋玻片 江蘇世泰實驗器材有限公司 10212432C
脫色搖床 Servicebio TSY-B
渦旋混合器 Servicebio MX-F
掌上離心機(jī) Servicebio D1008E
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
組化筆 Gene tech GT1001
正置熒光顯微鏡 日本尼康 Nikon Eclipse C1
成像系統(tǒng) 日本尼康 Nikon DS-U3
2、主要實驗試劑
試劑 廠家 貨號
無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
二甲苯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
PBS緩沖液 Servicebio G0002
破膜液 Servicebio G1204
蛋白酶K Servicebio G1205
BSA Servicebio G5001
Tunel試劑盒 Roche 11684817910
一抗
熒光二抗
DAPI Servicebio G1012
抗熒光淬滅封片劑 Servicebio G1401
二、石蠟切片熒光tunel+熒光實驗步驟
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時間稍微延長）。
2、修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育25min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
6、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
8、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光
三．石蠟切片熒光tunel+IF結(jié)果判讀
DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，tunel試劑盒為FITC熒光素標(biāo)記，陽性凋亡細(xì)胞為綠光，一抗標(biāo)記為紅色。
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